在現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究中，基因治療作為一種極有潛力的治療手段受到廣泛關(guān)注。而基因治療的關(guān)鍵在于高效、安全的基因載體。傳統(tǒng)的病毒載體雖然轉(zhuǎn)染效率高，但存在免疫原性、潛在致癌性等安全隱患。非病毒載體，如脂質(zhì)體和聚合物納米粒等，因其安全性優(yōu)勢而成為研究熱點。
多聚賴氨酸作為一種陽離子聚合物，具有良好的生物相容性和與核酸結(jié)合的能力。硅納米材料具有更好的物理化學(xué)性質(zhì)，如易于表面修飾、高穩(wěn)定性等。將多聚賴氨酸與硅納米材料結(jié)合制備新型納米粒子，有望綜合二者優(yōu)勢，開發(fā)出一種高效且低毒的細胞轉(zhuǎn)染載體。這對于推動基因治療和其他生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用具有重要意義。
材料
硅源（如正硅酸乙酯等）、多聚賴氨酸（不同分子量）、氨水（作為催化劑）、無水乙醇等有機溶劑、去離子水。同時準備用于后續(xù)實驗的核酸（如質(zhì)粒 DNA）。
儀器
磁力攪拌器、恒溫水浴鍋、離心機、掃描電子顯微鏡（SEM）、透射電子顯微鏡（TEM）、動態(tài)光散射儀（DLS）、傅里葉變換紅外光譜儀（FT - IR）等。
硅納米粒子的合成
在典型的合成過程中，將硅源（如正硅酸乙酯）溶解在無水乙醇和去離子水的混合溶液中，加入適量的氨水作為催化劑。在磁力攪拌下，反應(yīng)在一定溫度（如 30 - 50°C）下持續(xù)數(shù)小時。反應(yīng)完成后，通過離心收集硅納米粒子，并用乙醇和水多次洗滌以去除雜質(zhì)。
多聚賴氨酸的修飾
將合成的硅納米粒子分散在含有多聚賴氨酸的溶液中。通過靜電作用或化學(xué)鍵合（如硅烷偶聯(lián)劑介導(dǎo)）的方式使多聚賴氨酸附著在硅納米粒子表面。例如，當使用靜電作用時，硅納米粒子表面帶負電，多聚賴氨酸在合適的 pH 條件下帶正電，二者相互吸引。反應(yīng)在溫和的條件下進行一段時間（如 2 - 4 小時），然后通過離心等方法分離得到多聚賴氨酸硅納米粒子。
掃描電子顯微鏡（SEM）
將多聚賴氨酸硅納米粒子樣品分散在合適的溶劑中，滴在硅片上干燥后進行 SEM 觀察?？梢钥吹郊{米粒子的大小、形狀和表面形貌。結(jié)果顯示制備的納米粒子呈現(xiàn)出較為規(guī)則的球形，粒徑分布在一定范圍內(nèi)（如 50 - 200nm）。
透射電子顯微鏡（TEM）
TEM 可以提供更詳細的納米粒子內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息。通過 TEM 觀察到多聚賴氨酸在硅納米粒子表面形成了一層均勻的包覆層，進一步證實了修飾的成功。
動態(tài)光散射儀（DLS）
使用 DLS 測量多聚賴氨酸硅納米粒子在溶液中的粒徑分布和 Zeta 電位。結(jié)果表明，納米粒子具有較窄的粒徑分布，且 Zeta 電位呈正電性，這有利于與帶負電的核酸結(jié)合。
傅里葉變換紅外光譜儀（FT - IR）
FT - IR 分析可以檢測多聚賴氨酸硅納米粒子中的化學(xué)鍵變化。在光譜中可以觀察到硅 - 氧鍵的特征峰以及多聚賴氨酸中氨基等官能團的峰，同時可以看到修飾前后峰的變化，證明多聚賴氨酸與硅納米粒子的結(jié)合。
細胞系選擇
選擇多種常用的細胞系，如 HeLa 細胞（人宮頸癌細胞系）、293T 細胞（人胚腎細胞系）等。這些細胞系在基因轉(zhuǎn)染研究中具有代表性，其生長特性和對載體的反應(yīng)不同。
培養(yǎng)條件
將細胞培養(yǎng)在含有適當血清（如 10% 胎牛血清）和抗生素（如青霉素 - 鏈霉素）的培養(yǎng)基（如 DMEM 培養(yǎng)基）中，在 37°C、5% CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞生長至合適的密度（如 70 - 80% 融合度）時，用于后續(xù)轉(zhuǎn)染實驗。
納米粒子 - 核酸復(fù)合物的制備
將多聚賴氨酸硅納米粒子與核酸（如質(zhì)粒 DNA）在一定比例下混合在無血清培養(yǎng)基中，輕輕攪拌或振蕩使其充分結(jié)合形成復(fù)合物。通過改變納米粒子與核酸的質(zhì)量比、孵育時間等條件來優(yōu)化復(fù)合物的形成。
轉(zhuǎn)染操作
將制備好的復(fù)合物加入到細胞培養(yǎng)板中的細胞上，在 37°C、5% CO?培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)一定時間（如 2 - 4 小時）。然后更換為含有血清的完整培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。設(shè)置不同的實驗組，包括不同納米粒子濃度、不同細胞系等，同時設(shè)置陽性對照組（如使用商業(yè)化的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑）和陰性對照組（只加細胞和培養(yǎng)基）。
熒光顯微鏡觀察
當使用帶有熒光標記的核酸（如綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒 DNA）時，可以在轉(zhuǎn)染一定時間后（如 24 - 48 小時）通過熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)的熒光強度。統(tǒng)計熒光陽性細胞的比例來初步評估轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示多聚賴氨酸硅納米粒子在一定條件下能夠有效地將核酸導(dǎo)入細胞內(nèi)，不同細胞系中的轉(zhuǎn)染效率有所差異。
流式細胞術(shù)分析
進一步使用流式細胞術(shù)對轉(zhuǎn)染效率進行定量分析。通過檢測熒光標記核酸在細胞中的表達情況，可以更準確地計算出轉(zhuǎn)染效率。與熒光顯微鏡觀察結(jié)果相印證，得到不同實驗組的準確轉(zhuǎn)染效率數(shù)據(jù)。
MTT 法
在轉(zhuǎn)染后的不同時間點（如 24、48、72 小時），采用 MTT 法檢測細胞活力。將 MTT 試劑加入到細胞培養(yǎng)孔中，在細胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶的作用下，MTT 被還原為紫色的甲瓚結(jié)晶。通過溶解甲瓚結(jié)晶并測量其在特定波長下的吸光度，可以反映細胞的活力。結(jié)果表明多聚賴氨酸硅納米粒子在一定濃度范圍內(nèi)對細胞的毒性較低，具有較好的生物相容性。
LDH 釋放實驗
同時進行乳酸脫氫酶（LDH）釋放實驗。當細胞受損時，細胞膜通透性增加，LDH 會釋放到細胞外。通過檢測細胞培養(yǎng)上清液中的 LDH 活性，可以評估細胞的損傷程度。實驗結(jié)果進一步證實了多聚賴氨酸硅納米粒子在轉(zhuǎn)染過程中的低細胞毒性。
硅納米粒子合成條件的影響
硅源濃度、氨水用量、反應(yīng)溫度和時間等因素對硅納米粒子的粒徑和分散性有顯著影響。例如，增加硅源濃度可能導(dǎo)致粒徑增大，而合適的氨水用量有助于控制粒子的生長速度和粒徑均勻性。通過優(yōu)化這些條件，可以制備出粒徑合適、分散性良好的硅納米粒子，為后續(xù)多聚賴氨酸修飾提供良好的基礎(chǔ)。
多聚賴氨酸修飾條件的影響
多聚賴氨酸的分子量、濃度以及修飾反應(yīng)的時間和溫度等對多聚賴氨酸硅納米粒子的性能也至關(guān)重要。較高分子量的多聚賴氨酸可能在納米粒子表面形成更厚的包覆層，但可能會影響納米粒子的分散性。合適的修飾條件可以使納米粒子具有良好的正電性和穩(wěn)定性，有利于與核酸結(jié)合。
納米粒子 - 核酸比例的影響
不同的納米粒子與核酸質(zhì)量比會影響復(fù)合物的形成和轉(zhuǎn)染效率。當納米粒子過量時，可能會導(dǎo)致細胞攝取困難，而核酸過量則可能使復(fù)合物不穩(wěn)定。通過實驗確定最佳的比例范圍，可以提高轉(zhuǎn)染效率。
細胞系特異性
不同細胞系對多聚賴氨酸硅納米粒子的攝取和轉(zhuǎn)染效率不同。這可能與細胞表面受體、細胞膜通透性等細胞特性有關(guān)。例如，HeLa 細胞和 293T 細胞在相同轉(zhuǎn)染條件下轉(zhuǎn)染效率存在差異，這為針對不同細胞類型的基因治療應(yīng)用提供了參考。
多聚賴氨酸硅納米粒子在低濃度下表現(xiàn)出較低的細胞毒性，但隨著濃度的增加，可能會對細胞產(chǎn)生一定的影響。這可能是由于納米粒子在高濃度下的聚集、與細胞過度作用等原因。在實際應(yīng)用中，需要綜合考慮轉(zhuǎn)染效率和細胞毒性，選擇合適的納米粒子濃度，以確保在基因轉(zhuǎn)染過程中的安全性。
本文成功制備了多聚賴氨酸硅納米粒子，并對其進行了全面的表征。通過細胞轉(zhuǎn)染實驗研究了其在不同細胞系中的轉(zhuǎn)染效率和細胞毒性。結(jié)果表明，多聚賴氨酸硅納米粒子在合適的條件下具有良好的轉(zhuǎn)染性能和較低的細胞毒性，有望成為一種有潛力的基因載體。然而，還需要進一步深入研究其在體內(nèi)的生物分布、長期安全性等問題，為其在基因治療等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用提供更充分的依據(jù)。未來的研究可以聚焦于優(yōu)化制備方法以進一步提高轉(zhuǎn)染效率和降低細胞毒性，以及開展更多的體內(nèi)實驗研究。
