一、引言

高羊茅（Festuca arundinacea）作為一種重要的冷季型草坪草和優(yōu)質牧草，在全球范圍內廣泛種植。然而，隨著環(huán)境變化和對其品質要求的不斷提高，傳統(tǒng)的育種方法在提高高羊茅的抗逆性、品質和產量等方面面臨諸多挑戰(zhàn)。遺傳轉化技術為高羊茅的品種改良提供了一種極有潛力的途徑，其中農桿菌介導的遺傳轉化由于其具有插入片段穩(wěn)定性好、拷貝數低等優(yōu)點而備受關注。但長期以來，農桿菌介導高羊茅遺傳轉化一直存在轉化效率低、再生困難等問題，限制了其在高羊茅基因工程中的廣泛應用。近年來，在該領域取得了一系列新的突破進展，這些進展有望克服現有障礙，為高羊茅的遺傳改良帶來新的機遇。

二、農桿菌介導高羊茅遺傳轉化的傳統(tǒng)挑戰(zhàn)

（一）宿主特異性

農桿菌對高羊茅的侵染能力有限，這主要是由于高羊茅自身的防御機制和生理特性。高羊茅的細胞壁組成和結構可能阻礙農桿菌的附著和 T - DNA 的轉移，同時其內部的信號傳導途徑對農桿菌的識別和響應與其他模式植物存在差異。

（二）再生體系的復雜性

高羊茅的組織培養(yǎng)再生過程較為復雜，受到多種因素的影響。其愈傷組織誘導率低、分化能力差，而且不同基因型之間的再生能力差異顯著。這使得在轉化后難以獲得足夠數量的再生植株，從而影響了轉化效率的統(tǒng)計和后續(xù)研究。

（三）篩選標記的局限性

傳統(tǒng)的篩選標記在高羊茅遺傳轉化中可能存在一些問題。例如，一些抗生素篩選標記可能會對高羊茅的再生和生長產生負面影響，或者在自然環(huán)境中存在潛在的生物安全性風險。同時，篩選標記基因的表達可能受到高羊茅自身基因表達調控網絡的干擾，導致篩選結果不準確。

三、新突破進展：實驗方法與策略

（一）農桿菌菌株和載體的優(yōu)化

新型農桿菌菌株篩選

通過對多種農桿菌菌株的比較研究，發(fā)現了一些對高羊茅具有更高侵染效率的菌株。例如，經過改造的農桿菌菌株 AGL1 - ΔvirG，通過對其 vir 基因調控區(qū)的修飾，增強了其對高羊茅的識別和侵染能力。這種菌株能夠更好地適應高羊茅的細胞環(huán)境，提高 T - DNA 的轉移效率。

載體構建的改進

構建了具有更高效啟動子和增強子元件的雙元載體。在載體設計中，引入了高羊茅內源的強啟動子，如與生長發(fā)育相關基因的啟動子，來驅動目的基因的表達。同時，添加了特定的增強子元件，這些元件能夠與啟動子協同作用，增強基因表達水平。此外，優(yōu)化了載體上 T - DNA 邊界序列，減少了 T - DNA 在整合過程中的截斷和異常整合現象，提高了轉化的準確性和穩(wěn)定性。

（二）預處理提高高羊茅對農桿菌的敏感性

化學預處理

采用化學試劑對高羊茅外植體進行預處理。例如，在侵染前使用乙酰丁香酮（AS）處理高羊茅愈傷組織或幼嫩葉片，AS 能夠模擬植物受傷時產生的信號分子，激活農桿菌的 vir 基因表達，從而增強農桿菌的侵染能力。同時，還發(fā)現了一些新型的化學誘導劑，如特定的植物激素類似物，它們能夠在不影響高羊茅細胞活力的情況下，改變其細胞壁通透性，使農桿菌更容易進入細胞。

物理預處理

探索了物理方法對高羊茅外植體的預處理效果。通過超聲處理高羊茅愈傷組織，能夠在一定程度上破壞細胞壁結構，增加細胞壁的孔隙度，有利于農桿菌的附著和 T - DNA 的導入。此外，適度的電場處理也被發(fā)現可以提高農桿菌與高羊茅細胞的相互作用效率，但需要精確控制電場強度和處理時間，以避免對細胞造成不可逆的損傷。

（三）優(yōu)化轉化條件

共培養(yǎng)條件優(yōu)化

對農桿菌與高羊茅外植體的共培養(yǎng)條件進行了精細調整。研究發(fā)現，共培養(yǎng)溫度、時間和培養(yǎng)基成分對轉化效率有著至關重要的影響。將共培養(yǎng)溫度控制在 22 - 25℃，相較于傳統(tǒng)的 28℃，能夠顯著提高轉化效率。這可能是因為較低的溫度更有利于高羊茅細胞與農桿菌之間的相互作用和 T - DNA 的整合，同時減少了農桿菌的過度生長對高羊茅細胞的損害。延長共培養(yǎng)時間至 3 - 5 天，并在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加特定的氨基酸和維生素，為農桿菌和高羊茅細胞提供了更適宜的營養(yǎng)環(huán)境，促進了 T - DNA 的轉移。

選擇合適的外植體類型和發(fā)育階段

比較了不同類型的高羊茅外植體（如種子、幼葉、莖尖、愈傷組織等）在遺傳轉化中的效果。結果表明，幼嫩的葉片和由幼穗誘導產生的 Ⅱ 型愈傷組織是較為理想的外植體。幼葉細胞具有較高的分裂活性和對農桿菌的耐受性，而 Ⅱ 型愈傷組織具有較好的再生能力和對 T - DNA 的接受能力。同時，選擇處于特定發(fā)育階段的外植體也很關鍵，例如，在葉片展開后 7 - 10 天采集的幼葉，其細胞狀態(tài)適合農桿菌介導的轉化。

（四）新型篩選標記和篩選策略

無抗生素篩選標記系統(tǒng)

開發(fā)了基于代謝互補或可視化標記的新型篩選系統(tǒng)。例如，利用高羊茅細胞中某些營養(yǎng)代謝途徑的缺陷，構建能夠互補這種缺陷的基因作為篩選標記。當外植體成功轉化后，含有互補基因的細胞能夠在缺乏相應營養(yǎng)物質的培養(yǎng)基上正常生長，從而實現篩選目的。此外，采用可視化標記如熒光蛋白基因（如 GFP、RFP 等），通過熒光顯微鏡直接觀察和篩選轉化細胞，這種方法不僅避免了抗生素篩選標記的潛在風險，而且能夠更直觀、準確地識別轉化體。

多輪篩選策略

采用多輪篩選方法提高篩選的準確性。在第一輪篩選中，利用寬松的篩選條件初步篩選出可能的轉化體，然后在后續(xù)的培養(yǎng)過程中逐步提高篩選壓力。例如，在第一輪篩選中使用較低濃度的篩選試劑，讓部分轉化細胞和非轉化細胞都能生長，然后在第二輪篩選中增加篩選試劑濃度，淘汰那些假陽性的非轉化細胞。通過這種多輪篩選策略，可以有效減少假陽性結果，提高篩選得到的轉化植株的純度。

四、新突破進展的應用前景

（一）提高高羊茅的抗逆性

通過農桿菌介導的遺傳轉化，可以將抗逆相關基因導入高羊茅。例如，將抗旱基因（如編碼脫水蛋白的基因）、抗鹽基因（如 Na?/H?逆向轉運蛋白基因）和抗寒基因（如冷誘導蛋白基因）等導入高羊茅，有望培育出具有更強抗逆能力的新品種。這些新品種能夠在干旱、鹽堿和寒冷等惡劣環(huán)境條件下保持較好的生長狀態(tài)，擴大高羊茅的種植范圍，提高其在草坪和牧草生產中的適應性。

（二）改善高羊茅的品質

可以利用遺傳轉化技術改善高羊茅的品質特性。比如，導入與提高蛋白質含量相關的基因，增加高羊茅作為牧草的營養(yǎng)價值。同時，引入調控葉片質地和色澤的基因，培育出具有更美觀、柔軟葉片的高羊茅品種，滿足高等草坪市場的需求。此外，通過調控植物激素合成相關基因的表達，還可以改善高羊茅的生長習性，如降低其叢生性，使草坪更加平整。

（三）增強高羊茅的病蟲害抗性

將抗病蟲害基因導入高羊茅，增強其對常見病蟲害的抵抗能力。例如，導入抗真菌病害基因（如幾丁質酶基因、β - 1,3 - 葡聚糖酶基因等），可以有效抵御炭疽病、白粉病等真菌病害的侵襲。同時，引入抗蟲基因（如 Bt 毒蛋白基因、蛋白酶抑制劑基因等），減少高羊茅受到蝗蟲、蠐螬等害蟲的危害，降低農藥使用量，實現綠色環(huán)保的草坪和牧草生產。

五、討論與展望

盡管在農桿菌介導高羊茅遺傳轉化方面取得了新的突破進展，但仍然存在一些問題需要進一步解決。例如，雖然新型篩選標記和篩選策略在一定程度上提高了篩選效率，但對于一些復雜的基因轉化，可能仍然存在假陽性或假陰性的問題。此外，轉化過程中的一些物理和化學預處理方法可能對高羊茅細胞的基因組穩(wěn)定性產生潛在影響，需要進一步評估。

在未來的研究中，可以進一步探索更高效、更安全的遺傳轉化方法。結合基因編輯技術（如 CRISPR/Cas9）與農桿菌介導的遺傳轉化，實現對高羊茅基因的精準編輯和改良。同時，深入研究高羊茅的基因表達調控網絡，開發(fā)更適合高羊茅的啟動子和調控元件，提高目的基因的表達水平和穩(wěn)定性。此外，加強對轉化植株的長期監(jiān)測和評估，確保其在環(huán)境中的安全性和穩(wěn)定性，為高羊茅的遺傳改良和可持續(xù)利用提供更堅實的技術支持。

六、結論

綜上所述，農桿菌介導高羊茅遺傳轉化的新突破進展為高羊茅的遺傳改良帶來了新的希望。通過優(yōu)化農桿菌菌株和載體、預處理方法、轉化條件以及篩選策略等方面，顯著提高了轉化效率和轉化植株的質量。這些進展在提高高羊茅抗逆性、品質和病蟲害抗性等方面具有廣闊的應用前景，盡管仍面臨一些挑戰(zhàn)，但為未來高羊茅的基因工程研究和品種改良奠定了堅實的基礎。